沉降菌和浮游菌監(jiān)測作為日常生產(chǎn)過程中微生物

公司新聞????|???? ?2019-01-11 09:43:31
沉降菌和浮游菌監(jiān)測作為日常生產(chǎn)過程中微生物監(jiān)測的兩種方式
沉降菌監(jiān)測                                                       浮游菌監(jiān)測

沉降菌和浮游菌監(jiān)測作為日常生產(chǎn)過程中微生物監(jiān)測的兩種方式，一直在被大家廣泛使用。Chris在過去十多年中，也不斷被大家提問到 “到底應(yīng)該用浮游菌還是沉降菌監(jiān)測？”在新年伊始，我們來一起看看這兩種采樣方式的是是非非。

 

 
 
 

法規(guī)要求

 
 

 

GMP對于制藥行業(yè)內(nèi)測試方法需要參照ISO的測試方法，而ISO 14698-1微生物污染控制法規(guī)提到微生物監(jiān)測需要評估收集效率（Collection efficiency ），高的收集效率的采樣方法和采樣設(shè)備可以得到更有代表性的數(shù)據(jù)。對于生物負(fù)載環(huán)境低的環(huán)境，如A、B級環(huán)境，應(yīng)當(dāng)更多的采用主動采樣的浮游菌采樣，而不是被動采樣的沉降菌方法。

 

ISO 14698-1 附錄中對于微生物采樣器的收集效率提出了進行收集效率評估的指導(dǎo)意見。現(xiàn)行的2003版的ISO14698對于收集效率分為物理收集效率和生物收集效率，其中物理收集效率更在意的是采樣方法是否有能力收集到空氣的攜菌粒子，而生物收集效率更在意的是采樣器或者采樣方法是否能在收集到的同時保證該攜菌粒子的存活率。 
 

廠家有義務(wù)和有責(zé)任提供基于以上兩種收集效率的驗證文件。如果廠家無法提供，制藥企業(yè)需要開發(fā)相關(guān)的方法驗證證明其使用方法的收集效率。我們通常認(rèn)為以上兩種收集效率要達到一定的靈敏度以上方可使用（具體靈敏度要求以及驗證方法可向PMS咨詢）。

 

 
 
 

沉降菌的采樣效率

 
 

 

解決了上述微生物采樣器的采樣效率驗證，我們又回到了沉降菌的采樣效率評估，這是行業(yè)內(nèi)的痛點，因為我們都知道沉降菌的采樣方法屬于被動采樣方式，回收率相當(dāng)?shù)?，無法進行方法驗證。

 

 “Active Air vs. Passive Air (Settle Plate) Monitoring in Routine Environmental Monitoring Programs” （日常環(huán)境監(jiān)測計劃中的主動空氣與被動空氣沉降菌監(jiān)測的比較）(Reference 1).

——科學(xué)家Barbara M. Andon

美國注射劑行業(yè)協(xié)會（PDA）雜志

文章中對于沉降菌在無菌制藥生產(chǎn)日常監(jiān)測的收集效率進行評價后發(fā)現(xiàn)：基于地心引力的被動采樣方式，能夠得到12微米粒徑的活性粒子沉降到9cm的采樣平皿上的收集效率為0.106 CFU/h，沉降到14cm的采樣平皿上的收集效率為0.256CFU/h。而對于1微米粒徑的活性粒子沉降到9cm 的采樣平皿上的收集效率為0.008 CFU/h 。如果A級區(qū)最大濃度限度為1CFU/m3, 那么一個9cm 平皿需要暴露于A級區(qū)采樣1250小時（相當(dāng)于52天），才能在低生物污染負(fù)載環(huán)境檢測到一個有意義的數(shù)據(jù)（一個CFU）。

 

所以文中科學(xué)家得到結(jié)論：沉降菌“是一種太不靈敏的采樣方法”，以及“沉降菌更好的反映了攜菌粒子的沉積效果，僅在較大平皿采樣（如14cm）或者多個采樣平皿采集時靈敏些”。文中科學(xué)家發(fā)現(xiàn)對于主動采樣方法采集1微米的粒子的收集效率比9cm的被動采集的沉降菌方法的效率高2250倍。對于A級區(qū)層流環(huán)境的微生物采樣，建議采用更加靈敏的采樣方法。

 

Chris認(rèn)為沉降菌等采樣方法對于相對微生物負(fù)載量較高的非無菌工藝的C，D級環(huán)境，可以作為一個微生物采樣的補充，配合浮游菌采樣方法可以一起使用。對于A，B級環(huán)境，浮游菌采樣方法作為更高效的采樣方法更適合。

 

 
 
 

日常監(jiān)測中的風(fēng)險

 
 

 

如大家所知，歐盟GMP無菌生產(chǎn)的附錄一的草案于2017年12月24日發(fā)布，其中非常大的變化在于:

a) 微生物及相關(guān)的提法增加了2倍（原附錄提到23次，新草案提到68次）

b) 對于風(fēng)險的提法增加了將近4倍（原附錄提到20此，新草案提到92次）。

 

我們因此可以了解監(jiān)管部門對于微生物和風(fēng)險的要求重視程度達到前所未有的高度。其中對于日常監(jiān)測中，新附錄9.7條提到A級區(qū)的活性粒子（微生物）監(jiān)測位置應(yīng)該是無菌生產(chǎn)污染風(fēng)險最高的位置，如無菌表面，開口的容器膠塞等。而在9.29條提到，活性粒子（微生物）的采樣方法不應(yīng)當(dāng)對于制藥生產(chǎn)帶來任何污染的風(fēng)險(Reference 2)。因此，我們可以看到監(jiān)管部門的想法，他既認(rèn)為微生物監(jiān)測非常重要，又認(rèn)為采用不恰當(dāng)?shù)牟蓸臃椒〞ιa(chǎn)環(huán)境帶來負(fù)面影響。

 

這是我們行業(yè)的一個兩難。之前很多企業(yè)由于無法找到一個合適的微生物方法，擔(dān)心浮游菌采樣方法的平皿頻繁更換會對制藥環(huán)境帶來污染，因此決定不進行主動微生物（浮游菌）監(jiān)測。隨著現(xiàn)代制藥工業(yè)發(fā)展，我們已經(jīng)認(rèn)識到了需要提升我們對于微生物采樣方法的風(fēng)險評估和風(fēng)險識別。

 

 

 

沉降菌方法可能會對于環(huán)境造成污染，我們知道沉降菌表面有大量的營養(yǎng)水分，在10微米至20微米之間，當(dāng)沉降菌暴露在關(guān)鍵生產(chǎn)的A級環(huán)境中，這些營養(yǎng)水分很可能會被吹到無菌表面，藥瓶容器內(nèi)，藥液當(dāng)中，造成污染和交叉污



浮游菌采樣由于培養(yǎng)基比較容易干燥，現(xiàn)代的采樣流速設(shè)計為低流速采樣，可以盡量的延長浮游菌采樣的覆蓋生產(chǎn)的時間，不要頻繁進行平皿更換。通常會考慮到A級層流環(huán)境的氣流保護的目的，我們對浮游菌采樣也要進行等動力采樣設(shè)計，確保采樣器上方的空氣呈現(xiàn)等速采樣，不會對現(xiàn)場造成污染。PMS對于等動力采樣的設(shè)計為25升/分鐘，如使用市場上通用的9cm平皿，可持續(xù)40分鐘連續(xù)采樣；如采用PMS專利的一次性采樣平皿的技術(shù)，可持續(xù)2小時連續(xù)采樣。采用以上方法，可以最大化的減少對于A級環(huán)境更換平皿的干預(yù)動作

 

 

 



傳統(tǒng)的微生物采樣方法為把整個采樣器放入A級環(huán)境，而現(xiàn)代的無菌工藝控制方法要求任何進入A級的材料設(shè)備都要進行充分的滅菌。傳統(tǒng)方法把采樣器放入A級，由于采樣器內(nèi)部的線路板電氣部件無法進行徹底的滅菌，通常企業(yè)采樣VHP或者酒精消毒采樣器表面，無法到達徹底的滅菌的效果。WHO無菌工藝控制要求中建議制藥企業(yè)應(yīng)當(dāng)采樣分體式的微生物采樣方法，即把采樣頭和采樣器進行分離，采樣頭放入A級并可提前進行高溫或者化學(xué)滅菌，而采樣器放在B級背景環(huán)境進行操作。這樣的話，可以規(guī)避采樣器無法徹底滅菌對于A級區(qū)的影響。

今年來監(jiān)管部門發(fā)布了眾多“數(shù)據(jù)完整性和合規(guī)”的法規(guī)，我們在微生物監(jiān)測的過程中需要把計劃采樣的設(shè)置，實際采樣的情況都以滿足數(shù)據(jù)完整性的系統(tǒng)來進行記錄，比如什么時候開始，什么時候結(jié)束，實際采樣流速多少，計劃采樣流量或者時間多長，實際流量或者時間多少，什么人操作的，有沒有流速報警或者預(yù)警等等。現(xiàn)在的浮游菌采樣器的內(nèi)置軟件可設(shè)置三級權(quán)限，可對所有的采樣過程進行監(jiān)控，并生成不可更改的監(jiān)測記錄，方便進行追蹤。而沉降菌的采樣更依賴于紙質(zhì)記錄管理，流轉(zhuǎn)中的管理風(fēng)險較大。

 

 

 
 
 

結(jié)論

 
 

 

綜上而述，經(jīng)過效率驗證的浮游菌采樣方法對比沉降菌采樣方法的收集效率更為高效，適合用于關(guān)鍵的，生物負(fù)載低的無菌生產(chǎn)環(huán)境。而沉降菌采樣方法可作為一種生產(chǎn)過程中浮游菌采樣的補充方法，可用于相對不關(guān)鍵，生物負(fù)載高的非無菌環(huán)境，使用時需要避免放置位置不當(dāng)或者操作錯誤而造成的污染風(fēng)險。無論采用何種方法，都應(yīng)當(dāng)基于生產(chǎn)工藝的風(fēng)險評估來確定位置，采樣頻率，采樣覆蓋時間以及采樣流速等。

 

沉降菌和浮游菌作為制藥生產(chǎn)過程中的監(jiān)測方法，我們應(yīng)當(dāng)基于風(fēng)險評估來選擇和考慮采用哪一種方法。現(xiàn)代的無菌制藥控制對于關(guān)鍵區(qū)微生物采樣更傾向于主動采樣方式（浮游菌），而不是低靈敏度的被動采樣方法（沉降菌），需要重視采樣方法對于生產(chǎn)環(huán)境的影響，提高無菌工藝控制水平和基于風(fēng)險評估的科學(xué)方法。